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  • 一秒鐘了解pcr耗材,八聯排管、pcr96孔板的選擇

    發布日期:2023-11-09 17:08:54   瀏覽量 :129
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    今天,我們來聊聊PCR實驗中很關鍵的要素——耗材。作為PCR???,了解PCR耗材相關的特性和術語是有必要的。
    市面上的PCR耗材有很多,各種品牌、規格、顏色等,讓人眼花繚亂。我們來慢慢認識它。材質PCR耗材的原材料通常是聚丙烯。它是一種很好的耐熱惰性物質(使用溫度范圍為-30~140℃),能夠承受PCR反應熱循環過程中的熱能變化,很好地封閉和保護PCR反應體系中的物質。

    顏色常見的有白管和透明管。在傳統PCR實驗中,兩者沒有區別。但是,在相同的熒光定量/qPCR實驗中,對于頂端信號讀取的qPCR儀器(在管的上方采集熒光信號)來說,白管的靈敏度一致性相對更高(下圖A和B)。這是為什么呢?與透明管相比,A  白管得到的Ct值更低;B  白管得到的重復性更好

    qPCR的核心數據是Ct值,而熒光信號是Ct值計算的數據來源,所以管內的熒光能否完好地傳遞至檢測器是至關重要的。白色的管壁能夠阻止熒光穿過管壁和折射(下圖A),進而防止熒光傳至加熱模塊(放管子的金屬孔壁),被模塊吸收或發生不一致反射等情況。相比于透明管,在白管的頂端能夠采集到更強,更聚焦的熒光信號(下圖B)。

    A  透明管和白管中熒光信號走向;B  分別加入等量熒光素后,熒光強度對比

    So,假如你正在使用的是頂讀qPCR儀,那么安利一下,不妨用白管試試哦~

    • 質量(是否干凈)這里強調一下耗材質量的重要性。qPCR耗材必須保證沒有污染物和抑制劑。高壓和輻射能夠去除細菌和DNA酶,但不能去除灰塵和DNA殘留,它們可能會抑制PCR反應或產生非特異性擴增。物質是具有吸光度的,即便是很小的污染物也會吸收反應體系中的熒光,影響熒光信號的采集。用一個夸張版的實驗來演示一下雜質污染對實驗的影響,如下圖所示,在八聯排的一個反應孔中放入一粒雜質,不出所料,擴增結果曲線出現了顯著的異常。 
    • ↑  8復孔重復性反應結果,左邊孔中的雜質讓曲線“跑偏”

    Tips  注意不要讓耗材長期暴露在空氣中,取出耗材后,一定要快速封好包裝袋,避免用裸手接觸。有條件的話,可在超凈臺中操作。容量/尺寸/通量
    容量決定了可加樣的多少(反應體積)。加樣過多會導致熱傳導效率下降,溢出或交叉污染;而加樣不足會引起樣品蒸發損耗。qPCR儀的加熱模塊也會決定可適配的耗材和適用的反應體系大小。通量很容易理解,就是單次實驗最多能上多少個樣品。常見的容量和通量規格如下表所示:

     

     

    單管/八聯排

    0.2mL、0.1mL

    96孔板

    0.2mL、0.1mL

    384孔板

    0.02mL

    容量規格也常用標準和低容量來區分,如下圖所示。low profile(低容)耗材的高度更低,這種短小設計最大程度地減少了反應體系上方的空間(“死體積”——無用部分),降低熱循環過程中的蒸發影響,同時能夠讓加熱模塊更大程度地將其包裹,提高熱傳導效率。因此,低容管也被稱為“快速”管或板。

    Tips  常見的反應體積一般為20 µL,推薦使用0.1 mL或low profile的低容反應管。管壁厚度PCR耗材的管壁厚度要均一,才能提供一致的熱傳導。超薄管壁較標準版薄50%,可進一步減少熱屏障,帶來更快更好的反應效果。當然,建議選超薄的。
    透明度qPCR的管蓋和封膜需要具有很高的光學透性,確保最佳的熒光信號的穿透和傳遞,減少失真(針對頂讀qPCR儀)。管壁的透明度越高反倒會影響實驗結果,理由在前面解釋過。傳統PCR可忽略此特點。裙邊PCR板的裙邊指的是板的周圍延伸部分。額.......這個裙邊作用是在構建反應體系時為移液過程提供穩定性支撐,以及結合自動化工作站時提供機械強度和抓手。常見的有三種:無裙邊、半裙邊和全裙邊(對應下圖A、B、C)。
    Tips  簡單理解就是,裙邊的意義更多在于為工業化、自動化批量處理提供便利,與機械臂的結合。在常規科研實驗室中可能不太需要,使用無裙邊板即可。

    封板膜
    PCR封板膜由透明塑料或鋁箔制成。黏性透明薄膜比較常見,適配于96或384孔板,要有足夠好的光透性??梢栽诜饽r用個小卡片把孔周圍的膜壓緊,避免漏氣等現象。實驗室里的貼膜boy們應該很熟悉了吧??梢院唵卫斫鉃?.....

    黏性鋁膜可能比較少見,盡管不適合qPCR,但對于光敏樣品是最理想的耗材,由于可以穿刺,便于PCR中樣品轉移。(適用于傳統PCR)

    總結
    耗材作為PCR體系的載體,對提高實驗數據質量是非常重要的。希望本分享能夠讓你了解PCR耗材的一些小知識,為更好地選擇耗材提供幫助。ok,就到這兒了,下回見咯~

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